薄膜過濾法是微生物限度檢測樣品前處理的一個(gè)重要且普遍使用的方法，相較于平皿法、MPN法，薄膜過濾法能處理大體積樣品和含有抑菌成分的樣，且菌落截留在濾膜表面，分布均勻、計(jì)數(shù)直觀。但它也對操作有著嚴(yán)格要求：濾膜沒潤好會(huì)導(dǎo)致回收率偏低、沖洗不充分會(huì)出現(xiàn)假陰性、貼膜貼反或留氣泡整片膜作廢、組間滅菌不到位會(huì)交叉污染，所以任何一個(gè)環(huán)節(jié)出問題，數(shù)據(jù)會(huì)偏差或整批試驗(yàn)無效。下面我們就按實(shí)際操作順序，介紹從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、供試液制備、濾膜潤濕、過濾、沖洗到貼膜培養(yǎng)、計(jì)數(shù)報(bào)告的流程。

1.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：應(yīng)當(dāng)在生物安全柜或超凈工作臺(tái)內(nèi)操作，臺(tái)面用 75% 乙醇擦拭消毒。需要配備已滅菌且孔徑不大于 0.45μm過濾膜、過濾器、濾杯、帶負(fù)壓調(diào)節(jié)和真空表的干式抽濾泵、無菌鑷子、pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液。濾杯有可重復(fù)滅菌型和一次性無菌型兩類，樣品量大的實(shí)驗(yàn)室多用三聯(lián)/六聯(lián)多聯(lián)支架配一次性無菌濾杯，如圣斯特Sciencetool的BV-330-DPF和BV-630-DPF，卡壓式快裝、每組帶獨(dú)立閥門，換組不互相等待。準(zhǔn)備好瓊脂培養(yǎng)基，每批使用前做無菌檢查和促生長能力檢查。常規(guī)取 10g 或 10ml 供試品加緩沖液至 100ml 制成 1:10 供試液；含抑菌成分的可加大稀釋倍數(shù)或加經(jīng)驗(yàn)證的中和劑；油類樣品的濾膜和濾器須預(yù)先充分干燥。供試液從制備到接種不超過 1 小時(shí)，加熱不超過 45℃。

2.濾膜的濕潤：藥典明確要求水溶性供試液過濾前，先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。這是由于干濾膜接觸樣品液時(shí)不能瞬間均勻鋪展，膜面出現(xiàn)干斑，實(shí)際有效過濾面積變小，微生物被截留在干濕交界處，回收率下降；干膜與支撐墊片之間也容易殘留氣泡。向?yàn)V杯加入 10～20ml 沖洗液，使其覆蓋整個(gè)膜面，開負(fù)壓緩慢抽濾，待液體均勻透膜、無干區(qū)無氣泡即可，不必抽干，隨即加入供試液。一次性濾杯出廠已預(yù)裝封膜，拆封后直接潤濕；用可重復(fù)濾器的，裝膜時(shí)確認(rèn)濾膜平鋪、無褶皺破損。

3.供試液過濾：取相當(dāng)于 1g、1ml 或 10cm2 供試品的供試液，加適量稀釋液混勻后注入濾杯；純化水、注射用水等低菌量水樣取大體積（100ml 或按品種項(xiàng)下規(guī)定）直接過濾，靠大體積富集提高檢出率。開啟抽濾泵后，建議調(diào)節(jié)負(fù)壓，使液體以平穩(wěn)速度透膜。負(fù)壓過小過濾慢、液體長時(shí)間滯留；過大則可能損傷膜面截留的微生物，也易使濾膜變形貼網(wǎng)。BV-330-DPF和BV-630-DPF多聯(lián)支架的每組通道閥門獨(dú)立控制，樣品湊得齊就同時(shí)過濾，湊不齊只開其中幾組；先濾完的組關(guān)閥泄壓、取膜，不必等必須湊滿支架濾杯數(shù)的樣品。

4.濾膜沖洗：這一步是為了洗走截留在膜上的抑菌成分，如防腐劑、抗生素殘留。沖洗不充分，膜上的菌等于被"泡"在抑菌物里，培養(yǎng)后長不出來，結(jié)果就是假陰性——污染樣品被誤判合格，這是微生物檢驗(yàn)最危險(xiǎn)的結(jié)果。沖洗液沿濾杯內(nèi)壁緩緩加入，不要直接沖擊膜面，避免沖脫已截留的微生物。還需要分次加入、每次抽干后再加下一次，不要一次性倒?jié)M浸泡了事。沖洗量按藥典規(guī)定每次 100ml、沖洗次數(shù)不超過 5 次、總量一般不超過 500ml。還需要同步做陰性對照，取同等體積沖洗液單獨(dú)過濾一張膜、貼膜培養(yǎng)，陰性對照不得長菌，一旦長菌，說明沖洗液、耗材或環(huán)境有污染，本次試驗(yàn)直接無效。

5.取膜與貼膜：用無菌鑷子夾取濾膜邊緣，菌面朝上平貼到培養(yǎng)基平板上，截留微生物的一面朝向空氣，濾膜底面貼合瓊脂，營養(yǎng)透過濾膜持續(xù)供給膜面微生物。貼反則菌落無法在膜面正常形成，無法計(jì)數(shù)。貼膜時(shí)從濾膜一側(cè)向另一側(cè)緩緩放下，再用鑷子背輕壓膜面，趕凈膜與瓊脂之間的氣泡；氣泡覆蓋處微生物得不到營養(yǎng)，會(huì)形成空白斑。鑷子只夾濾膜邊緣，手套、手指、器壁都不要接觸膜中央截留區(qū)。

6.培養(yǎng)與計(jì)數(shù)：需氧菌總數(shù)貼 TSA 平板，30～35℃ 培養(yǎng) 3～5 天；霉菌和酵母菌總數(shù)貼 SDA 平板，20～25℃ 培養(yǎng) 5～7 天。每張濾膜菌落數(shù)應(yīng)不超過 100cfu，超出則減量或提高稀釋級重測。無菌落生長以 <1 報(bào)告（或 <1 乘以稀釋倍數(shù)）。陰性對照無菌生長、回收試驗(yàn)正常，結(jié)果方為有效。

7.交叉污染的預(yù)防： 可重復(fù)濾杯每做完一個(gè)樣品必須重新滅菌。批量檢測時(shí)，一次性濾杯"一杯一樣品、用完即棄較為穩(wěn)妥，從根源上消除清洗殘留和滅菌隱患，BV-330-DPF和BV-630-DPF都配備的是一次性已滅菌的塑料濾杯，即拆即用。多聯(lián)支架的不銹鋼基座和濾膜支撐片會(huì)接觸濾液，更換樣品時(shí)可用配套的手持式火焰滅菌槍對支撐片、濾頭快速灼燒滅菌，再進(jìn)行下一組。

8，預(yù)防液體倒吸進(jìn)抽濾泵：倒吸多發(fā)生在廢液瓶過滿、關(guān)機(jī)順序錯(cuò)誤時(shí)。圣斯特的多聯(lián)過濾系統(tǒng)設(shè)備層面均有三道防護(hù)：集液瓶抽氣口浮球逆止閥（液滿自動(dòng)關(guān)閉）、管路中的疏水阻水保護(hù)器、泵進(jìn)氣端帶濾芯的緩沖杯。操作上注意廢液瓶及時(shí)排液，帶底部排液口的集液瓶松開管夾即可快速導(dǎo)出，別等液滿報(bào)警才處理。